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Selektive Modifizierung von Cysteinresten mit Derivaten der Arsonigen Säure zur massenspektrometrischen Charakterisierung von Disulfidstrukturen in Proteinen und Faltungsintermediaten des Makrophagen-Kolonie Stimulationsfaktors (M-CSF)

Diplomarbeit

Der Fakultät für Chemie der Universität Konstanz

vorgelegt von

PeterHappersberger
 

Konstanz, im Mai 1996

• Danksagung
• Widmung
• Abkürzungen

• Inhaltsverzeichnis

• 1. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG
• 1.1 Cysteinylthiolgruppen und Disulfidstrukturen in Proteinen
• 1.1.1 Bedeutung der Cysteinylthiolgruppen für Proteinstruktur und -funktion
• 1.1.2 Bedeutung der Disulfidstrukturen in der Proteinfaltung
• 1.1.3 Proteinchemische Methoden zur Charakterisierung von Cysteinylthiolgruppen
• 1.2 Derivate der Arsonigen Säure als chemoselektive Modifizierungsreagenzien
• 1.2.1 Nomenklatur von trivalenten Organoarsen(III)verbindungen
• 1.2.2 Chemische, physikalische und strukturelle Eigenschaften der Arsonigen Säure und ihrer Anhydride
• 1.2.3 Chemische Reaktionen Arsoniger Säuren mit Dithiolen
• 1.3 Massenspektrometrische Methoden zur Charakterisierung von proteinchemischen Umsetzungen
• 1.4 Bedeutung, Struktur und biologische Funktion desMakrophagen- Kolonie- Stimulationsfaktors (M-CSF)
• 1.4.1 Biologisch aktive Formen des M-CSF
• 1.4.2 Bekannte Struktur- und Funktionsmerkmale des M-CSF
• 1.4.3 Bekannte Rückfaltungreaktionen und Rückfaltungsintermediate von M-CSF
• 1.5 Zielsetzung und Aufgabenstellungen der Arbeit

• 2. ALLGEMEINER TEIL
• 2.1 Synthese von Derivaten der Arsonigen Säure
• 2.1.1 Synthese des Anhydrids von Pyridin-3-arsoniger Säure (PYR)
• 2.1.2 Synthese vonp-(4,6-Diamino-s-triazin-2-yl)aminophenylarsoniger Säure (Melarsen Oxid, MEL)
• 2.1.3 p-Aminophenylarsonige Säure (A-PAA)
• 2.1.4 UV-spektroskopische Charakterisierung und Löslichkeitsverhalten der Arsonigsäure-Derivate
• 2.2 UV-spektroskopische Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus der Modifizierung von Bis-Thiolen mit Melarsen Oxid
• 2.2.1 Die Cystinreduktionsmittel DTT und TCEP
• 2.2.2 Analyse des Reaktionsverlaufs - Chemische Selektivität und Stöchiometrie der Modifizierungsreaktion mit Melarsen Oxid
• 2.2.3 Zeitlicher Verlauf der Reaktion in Abhängigkeit des pH-Werts und des verwendeten Puffersystems
• 2.3 Massenspektrometrische Charakterisierung der Reaktionsprodukte von Modellpeptiden mit Arsonigen Säuren
• 2.3.1 Umsetzung von Dicysteinylpeptiden mit Derivaten der Arsonigen Säure
• 2.3.2 Umsetzung von cystinylhaltigen Modellpeptiden mit Derivaten der Arsonigen Säure
• 2.4 Untersuchungen zur Stabilität der Reaktionsprodukte von mit Melarsen Oxid modifizierten Modellpeptiden
• 2.4.1 Unspezifische Modifizierung und Dimerbildung als Artefakt der Probenpräparation
• 2.4.2 Stabilität der Arsenmodifizierung für verschiede pH-Werte und Puffersysteme
• 2.4.3 Spaltung der Arsen-Schwefel Bindung in Peptiden mit 1,4-Dithiothreitol
• 2.5 Anwendung der Arsonigen Säuren als Schutzgruppe für Biscysteinyl-Gruppierungen in Peptiden gegen Alkylierungsmittel
• 2.6 Selektive chemische Modifizierung von Modellproteinen mit Melarsenoxid und massenspektrometrische Charakterisierung der Reaktionsprodukte
• 2.6.1 Umsetzung von Dicysteinylproteinen mit Melarsen Oxid
• 2.6.2 Umsetzung von cystinylhaltigen Modellproteinen mit Melarsen Oxid und ihre Reinigung über HPLC
• 2.6.3 Untersuchungen zum proteolytischen und chemischen Abbau von Vas-MEL und der MEL-modifizierten B-Kette des Insulins
• 2.7 Charakterisierung der in vitro Rückfaltungsreaktion von rhM-CSF
• 2.7.1 Reduktion von rhM-CSF und quantitative Umsetzung mit Melarsen Oxid
• 2.7.2 Reduktion von rhM-CSF mit TCEP in Anwesenheit von Melarsen Oxid und massenspektrometrische Charakterisierung des Reaktionsprodukts
• 2.7.3 Charakterisierung des Reaktionsverlaufs der in vitro Rückfaltungsreaktion durch Molekulargewichtsbestimmung der Faltungsintermediate
• 2.8 Computerberechnungen von lösungsmittelzugänglichen Oberflächen in Proteinen mit bekannter Struktur

• 3. EXPERIMENTELLER TEIL
• 3.1 Reagenzien und Proteine
• 3.2 Synthesen von Derivaten der Arsonigen Säure
• 3.2.1 Pyridin-3-arsonigsäuredichlorid Monochlorhydrat
• 3.2.2 Anhydrid der Pyridin-3-arsonigen Säure (PYR)
• 3.2.3 p-(4,6-Diamino-1,3,5-triazin-2-yl)aminophenylarsonsäure
• 3.2.4 p-(4,6-Diamino-1,3,5-triazin-2-yl)aminophenylarsonige Säure Monohydrat (MEL)
• 3.2.5 p-Aminophenylarsonige Säure (A-PAA)
• 3.3 UV-spektroskopische Untersuchungen
• 3.3.1 Extinktionskoeffizient und Löslichkeit der synthetisierten Arsonigen Säuren
• 3.3.2 Stöchiometrie und zeitlicher Verlauf der Modifizierung von Bis-Thiolen mit Melarsen Oxid (MEL)
• 3.4 Peptid- und Proteinchemische Umsetzungen
• 3.4.1 Reduktion von Disulfidbrücken mit 1,4-Dithiothreitol und Tris-(2-carboxyethyl)phosphin
• 3.4.2 Alkylierung von Cysteinylthiolgruppen mit Iodacetamid und 4-Vinylpyridin
• 3.4.3 Modifizierung von Biscysteinylthiolgruppen mit Arsonigen Säuren
• 3.4.4 Proteolytische Abbaureaktionen
• 3.4.5 Bestimmung der Thiolkonzentration mit Ellmans Reagenz
• 3.5 Stabilitätsuntersuchungen
• 3.6 Proteinreinigung und Proteinbestimmung
• 3.6.1 SepPak-C18-RP-Kartuschen
• 3.6.2 Ultrafiltration (Microcon)
• 3.6.3 Hochdruckflüssigkeitschromatographie
• 3.6.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
• 3.6.5 Bradfordassay zur Bestimmung der Proteinkonzentration
• 3.7 Analytische Charakterisierungsmethoden
• 3.7.1 Elektronen-Ionisations-Massenspektrometrie
• 3.7.2 Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie
• 3.7.3 252Cf-Plasmadesorptions- Massenspektrometrie
• 3.7.4 Elektrospray- Massenspektrometrie
• 3.7.5 Matrixunterstützte-Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie
• 3.7.6 NMR-Spektroskopie
• 3.8 Faltungsreaktionen von rhM-CSF
• 3.9 Computerprogramme
• 4.ZUSAMMENFASSUNG
• 5.LITERATURVERZEICHNIS

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Diese Seite wurde erstellt am 15. März 1998. Letzte Änderungen am 30. Juni 1998 durchPeter Happersberger.