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2.3 Massenspektrometrische Charakterisierung der Reaktionsprodukte von Modellpeptiden mit Arsonigen Säuren |
2.4 Untersuchungen zur Stabilität der Reaktionsprodukte von mit Melarsen Oxid modifizierten Modellpeptiden
2.4.1 Unspezifische Modifizierung und Dimerbildung als Artefakt der Probenpräparation
Wie in den vorangegangenen Kapiteln gezeigt, reagieren mit Ausnahme von PYR alle hier verwendeten Derivate der Arsonigen Säure mit Dithiolen und Biscysteinylpeptiden selektiv zu stöchiometrisch einheitlichen Produkten. Für die Aufarbeitung der Produkte muß jedoch erst die Stabilität der Produkte, sowie das geeignete Verfahren ermittelt werden, um Artefaktbildungen auszuschließen.
Unspezifische, kovalente Zweifachmodifizierungen wurden für die Umsetzung von Oxytocin (OT) mit den hier verwendeten Derivaten der Arsonigen Säure nach Aufkonzentration der Reaktionslösungen durch Lyophilisieren in Gegenwart aller Reaktanden beobachtet. Die Zweifachmodifizierungen wurden unabhängig vom verwendeten Reduktionsmittel und den eingesetzten molaren Verhältnissen OT / Reduktionsmittel/ Arsonige Säure (siehe 3.4.3) beobachtet. Der Nachweis erfolgte durch MALDI-MS-Analyse der erhaltenen Lyophilisate. Die unspezifischen Zweifachmodifizierungen der Arsonigen Säuren PAA, MEL und A-PAA lassen sich vermeiden, wenn überschüssige Reagenzien vor dem Lyophilisieren durch C18-SepPak-Kartuschen oder C18-RP-HPLC (siehe 3.6) abgetrennt werden.
Eine weitere Artefaktbildung ist die Entstehung von MEL-modifizierten Vasopressin-Dimeren aus dem ursprünglich einfach MEL-modifizierten Vasopressin (Vas-MEL). Diese Dimere wurden nach dem Lyophilisieren von HPLC-Fraktionen, also nach Abtrennung aller überschüssigen Reagenzien, sowohl durch MALDI-MS als auch durch PD-MS und ESI-MS nachgewiesen, und stellen somit keine Artefakte der MS-Methode dar. InAbb. 55 sind die vorgeschlagenen Strukturen am Beispiel von Vas-MEL schematisch dargestellt. Die beiden Peptidketten sind (über ihre Cysteinreste) durch ein bzw. zwei Moleküle MEL verbrückt. Im Gegensatz zu den intramolekularen Vas-MEL-Addukten (Monomer) stellen die Dimere intermolekulare Vas-MEL-Addukte dar. Die Dimerbildung aus den monomeren MEL-Peptidderivaten kann durch säurekatalysierte Umesterungen der Arsonigsäuredithioester erklärt werden. Das Vas-MEL1-Vas Dimer ist eine offenkettige Verbindung und sollte aufgrund der geringeren Stabilität offenkettiger Arsonigsäuredithioester (siehe 1.2.3) zu einem geringeren Anteil vorliegen. In Abb. 56 ist der Einfluß der Probenpräparation auf die Bildung intermolekular verbrückter Vas-MELn-Vas Dimere (n = 1, 2) von HPLC-gereinigtem Vas-MEL dargestellt. Die MALDI-Massenspektren der HPLC-Fraktionen (siehe S. 53) vor (Abb. 56 A) und nach Lyophilisieren (Abb. 56 B), sowie nach 2 h Inkubation bei 37 C in 0.1% TFA (pH 2) (Abb. 56 C) zeigen die zunehmende Bildung von Vas-MEL2-Vas (m/z 2721). MALDI-Massenspektren von HPLC-Fraktionen, die vier Wochen bei -20 C aufbewahrt wurden, zeigen keine zunehmende Dimerbildung.
Vas-MEL1-Vas Vas-MEL2-Vas
offenkettig zyklisch
(m/z 2445) (m/z 2721)
Abb. 55: Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Strukturen für die kovalenten Dimere am Beispiel von Vas-MEL. In beiden Fällen erfolgt eine intermolekulare Verknüpfung der Peptidketten (über die Cysteine) durch MEL. Aufgrund säurekatalysierter Umesterungsreaktionen von monomerem Vas-MEL liegt das Dimer Vas-MEL1-Vas vermutlich in der offenkettigen Form vor.
Abb. 56: MALDI-Massenspektren von HPLC-gereinigtem Vas-MEL. (A) vor (B) nach Lyophilisieren und (C) nach 2 h Inkubation bei 37 C in 0.1% TFA (pH 2). Die kovalenten Dimere (sieheAbb. 55) sind durch große Pfeile gekennzeichnet. Deutlich erkennt man die zunehmende Bildung des intermolekular verbrückten Vas-MEL2-Vas Dimers.
Bei der MALDI-MS-Charakterisierung der Peptid-Arsonigsäuredithioester können säurekatalysierte Umesterungen mit der MALDI-Matrix eine Rolle spielen. Die für die MALDI-MS-Analyse von Peptiden und Proteinen verwendeten Matrizes enthalten funktionelle OH-(SH-)Gruppen und werden - meist unter sauren Bedingungen - in einem hohen Überschuß (1000 bis 10000-fach) mit der Analytlösung kokristallisiert. Unter diesen Bedingungen ist die Bildung von gemischten Matrix-Peptid-Arsonigsäurediester möglich. Es wurden MALDI-Massenspektren von HPLC-gereinigtem Vas-MEL für verschiedene Matrizes aufgenommen. Das erhaltene Spektrum für die Matrix -Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA, Abb. 57 A) zeigt neben Vas-MEL (m/z 1361) nur geringe Anteile an Vas (m/z 1085) und des HCCA-Matrixaddukts von Vas-MEL (m/z 1550). Anhand des bestimmten Molekulargewichts läßt sich das kovalente HCCA-Vas-MEL-Addukt (m/z 1550, siehe vorgeschlagene Struktur in Abb. 57) nicht vom nicht kovalenten unterscheiden. Jedoch zeigt nicht modifiziertes Vasopressin keine HCCA-Addukte, so daß eine kovalente Verknüpfung der Matrix über das Arsenatom wahrscheinlich ist. In Abschnitt 2.1.2 wurde bereits gezeigt, daß MEL mit HCCA kovalente MEL-HCCA-Addukte bildet (siehe Abb. 30). Das MALDI-Massenspektrum für die Matrix 2,6-Dihydroxyacetophenon (DHAP,Abb. 57 B) zeigt neben dem Vas-MEL-DHAP-Matrixaddukt (m/z 1512) und Vas-MEL (m/z 1361) einen deutlich höheren Anteil an nicht modifiziertem Vasopressin (m/z 1085). Dagegen zeigt das MALDI-Massenspektrum für die Matrix 6-Aza-2-thiothymin (ATT,Abb. 57 C) neben gleich intensiven Signalen von Vas (m/ 1085) und Vas-MEL (m/z 1361), sowohl Matrixaddukte des nicht modifizierten Vasopressins (Vas-ATT, m/z 1228) als auch von Vas-MEL (Vas-MEL-ATT, m/z 1504). Für die weitere MALDI-MS-Charakterisierung von Peptid-/Protein-arsonigsäuredithioester wurde ausschließlich HCCA als Matrix verwendet, da diese Matrix im MALDI-Massenspektrum (Abb. 57 A) die geringsten Matrixartefaktreaktionen zeigte.
Abb. 57: MALDI-Massenspektren von HPLC-gereinigtem Vas-MEL für die verwendete Matrix (A) -Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA), (B) 2,6-Dihydroxyacetophenon (DHAP) und (C) 6-Aza-2-thiothymin (ATT). Dargestellt sind die Strukturformeln der Matrizes und die vorgeschlagene Struktur des HCCA-Vas-MEL Addukts.
2.4.2 Stabilität der Arsenmodifizierung für verschiede pH-Werte und Puffersysteme
Der zeitliche Verlauf der Hydrolyse von Arsonigsäuredithioester in die entsprechende Arsonige Säure und Dithiol (siehe Abb. 7) wurde in Abhängigkeit des pH-Werts und Puffersystems MALDI-massenspektrometrisch verfolgt. Dazu wurde HPLC-gereinigtes Vas-MEL aliqoutiert und lyophilisiert (siehe S. 53). Die Lyophilisate wurden in den entsprechenden Puffern (Tab. 6) gelöst (cvas-mel 0.5 µg/µl) und 24 h bei 25 C inkubiert.
Tab. 6: Verwendete Puffer und pH-Werte zur Untersuchung der Stabilität von Vas-MEL.
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Gruppe 1 |
Puffer |
pH-Wert |
Gruppe 2 |
Puffer |
pH-Wert |
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10 mM NH4HCO3 |
8.0 |
50 mM NH4HCO3 |
8.0 |
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10 mM NH4HCO3 |
7.0 |
50 mM NH4H2PO4 |
8.0 |
|||
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10 mM NH4OAc |
6.0 |
50 mM Tris |
8.0 |
|||
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10 mM NH4OAc |
5.0 |
50 mM NaH2PO4 |
8.0 |
|||
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10 mM NH4OAc |
4.0 |
50 mM HEPES |
8.0 |
|||
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10 mM Glycin |
2.0 |
50 mM NH4H2PO4 |
4.0 |
|||
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H2O (MilliQ) |
6-7 |
50 mM NaH2PO4 |
4.0 |
Die verwendeten Puffersubstanzen unterscheiden sich in ihrer Nukleophilie. Beispielsweise liegt in wäßriger Lösung (pH 8) das Gleichgewicht zwischen Ammoniak und dem Ammonium-Ion weit auf der Seite des nukleophilen Ammoniaks (K = 1.8 10-5). Die Nukleophilie des primären Amins in Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) ist höher als die der tertiären Aminofunktionen in N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES).
In Abb. 58 ist der zeitliche Verlauf bei 25 C der Hydrolyse von Vas-MEL in nukleophilen Puffersystemen am Beispiel 50 mMNH4HCO3 pH 8.0 und 50 mMNaH2PO4 pH 8.0 gezeigt. Aus den Signalintensitäten von Vas (m/z 1085) und Vas-MEL (m/z 1361) wurde auf den Anteil an noch modifiziert vorliegendem Vasopressin geschlossen. Weitere Signale mit geringerer Intensität waren bei m/z 1550 für das Vas-MEL-HCCA-Matrixaddukt (s.o.) zu erkennen, wurden aber für die Auswertung vernachlässigt.
In Abb. 59 sind die so ermittelten relativen Intensitäten von Vas-MEL in Abhängigkeit der Zeit aufgetragen. Dabei entspricht 100% der Summe der Signalintensitäten von Vas und Vas-MEL. Der Anteil an Vas-MEL direkt nach Lyophilisieren betrug 85 % (0.1 % TFA).Abb. 59 A zeigt den zeitlichen Verlauf der Hydrolyse in Abhängigkeit des pHs (Gruppe 1). Die durchgezogenen Linien wurden an die jeweiligen Meßwerte angefittet. Mit abnehmendem pH-Wert sinkt die Hydrolysegeschwindigkeit von Vas-MEL deutlich. Bei pH 2 ist Vas-MEL über den beobachteten Zeitraum stabil. Abb. 59 B zeigt den Einfluß verschiedener Puffersysteme bei pH 8 und pH 4. Bei pH 8 hydrolysieren nukleophile Puffersysteme (Ammonium im Gleichgewicht mit Ammoniak; Tris) die As-S Bindung deutlich schneller als nicht nukleophile Puffersysteme (Natriumdihydrogenphosphat und HEPES). Die Hydrolyse in 50 mM NH4HCO3 pH 8.0 erfolgt innerhalb einer Stunde nahezu quantitativ. In Übereinstimmung dazu zeigen Untersuchungen von Cohen et al. [55], daß p-Benzamido-arsonigsäuredithioester inNaHCO3-Puffer nur geringfügig hydrolysieren.
Abb. 58: MALDI-Massenspektren des zeitlichen Verlaufs der Hydrolyse von Vas-MEL bei 25 C in (A) 50 mM NH4H2PO4 pH 8.0 und (B) 50 mM NaH2PO4 pH 8.0 vor Zugabe (0h) bzw. 1 h und 3 h nach Zugabe des jeweiligen Puffers.
Abb. 59: (A) Zeitlicher Verlauf der Hydrolyse von Vas-MEL bei 25 C in Abhängigkeit des pH-Werts. Die verwendeten Puffer sind in Tab. 6 aufgeführt (Gruppe 1). (B) Analog (A), jetzt für unterschiedlich nukleophile Puffersysteme bei pH 8 und pH 4 (Tab. 6, Gruppe 2).
Bei pH 4 liegt das Gleichgewicht zwischen Ammonium-Ion und Ammoniak weit auf der Seite des Ammonium-Ions, so daß die Hydrolysegeschwindigkeit nahezu unabhängig von der Nukleophilie des Puffersystems ist (Abb. 59 B). Interessanterweise erfolgt in Wasser (MilliQ, pH 4-6) keine Hydrolyse von Vas-MEL.
2.4.3 Spaltung der Arsen-Schwefel Bindung in Peptiden mit 1,4-Dithiothreitol
Wie schon in Abschnitt 1.2.3 erwähnt können makrozyklische Arsonigsäuredithioester durch Zugabe von niedermolekularen Dithiolen gespalten werden. Analog zu Abschnitt 2.4.2 wurde HPLC-gereinigtes und lyophilisiertes Vas-MEL (siehe S. 53) in den inTab. 6 aufgeführten Puffer gelöst (cvas-mel 0.5 µg/µl). Zu diesen Lösungen wurden im 10-fachen molaren Überschuß DTT zugegeben und nach 15' Inkubationszeit bei 25 C MALDI-Massenspektren gemessen. Für alle pH-Werte und Puffersysteme erfolgt die vollständige Abspaltung von MEL vom Vasopressin-MEL-Addukt (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu den UV-spektroskopischen Untersuchungen (siehe 2.2.2), die keine Aussage über die Stabilität des gebildeten Arsonigsäuredithioesters ermöglichten, bestätigen die hier erhaltenen Ergebnisse die höhere Stabilität des entstehenden DTT-MEL-Addukts und stehen im Einklang mit der Literatur [44].
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2.3 Massenspektrometrische Charakterisierung der Reaktionsprodukte von Modellpeptiden mit Arsonigen Säuren |
Diese Seite wurde erstellt am 15. März 1998. Letzte Änderungen am 30. Juni 1998 durchPeter Happersberger.