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2.7 Charakterisierung der in vitro Rückfaltungsreaktion von rhM-CSF |
2.8 Computerberechnungen von lösungsmittelzugänglichen Oberflächen in Proteinen mit bekannter Struktur
Um Struktur und Funktion von Proteinen zu untersuchen, ist es nützlich die äußere Oberfläche der Makromoleküle möglichst genau zu kennen. Für die an der Reaktion mit MEL beteiligten Cysteine sollten deren Oberflächenzugänglichkeiten anhand der Röntgenstrukturdaten des rhM-CSF [116] berechnet werden. Für Moleküle unterscheidet man Van der Waals Oberflächen (VdW Oberflächen), statisch zugängliche Oberflächen (static accessible surface area, AS) undlösungsmittelzugängliche Oberflächen (solvent accessible surface, SAS) oder auch Connolly-Oberflächen.
Die VdW Oberfläche eines Moleküls wird dadurch ermittelt, daß man jedem Atom des Moleküls eine Kugel mit dem entsprechenden VdW Radius zuordnet und somit ein raumerfüllendes Modell (sog. CPK-Modell) konstruiert [149]. Die Bindungslänge zwischen zwei Atomen und das Verhältnis ihrer VdW Radien beeinflußt die Größe der nicht verdeckten Kugeloberflächen. Die Gesamtoberfläche aller Atome wird als VdW Oberfläche des Moleküls bezeichnet. Nun rollt man eine imaginäre Probenkugel mit festgesetztem Radius (meist 1.4 Å entsprechend dem effektiven Radius eines Wassermoleküls) über diese VdW Oberfläche. Die AS Oberfläche wird als Einhüllende aller Punkte beschrieben, durch die das Zentrum der Probenkugel verlaufen kann, solange die Probenkugel in irgend einer Form Kontakt mit der VdW Oberfläche hat (siehe Abb. 87) [149]. Dagegen setzt sich die Connolly Oberfläche aus zwei unterschiedlichen Oberflächentypen zusammen. Die Contact Area (CA) stellt den Teil der molekularen VdW Oberfläche dar, der in direktem Kontakt mit der Probenkugel steht. Die Reentrant Area (RA) wird durch einen Teil der inneren Oberfläche der Probenkugel definiert, wenn diese im gleichzeitigen Kontakt mit mehr als einem Atom steht. Die Summe von CA und RA entspricht der Connolly Oberfläche, die auch als Total Area (TA) bezeichnet wird (sieheAbb. 87) [149], [150].
Zur Berechnung der Connolly Oberflächen beliebiger Atome innerhalb eines Proteins wurde ein Makro geschrieben, das eine wesentlich einfachere Handhabung der Eingabeparameter und der erhaltenen Ergebnisse des im Programm INSIGHT II (Fa. Biosym) enthaltenen Connolly-Algorithmus [151] ermöglichte. Explizit wurden die Connolly Oberflächen der S-Atome der Cysteine des verkürzten rhM-CSF (4-154) (siehe 1.4.2) für das Homodimer, mit intakten Disulfidstrukturen, und für daraus konstruierte Polypeptidketten berechnet. Die Polypeptidketten enthielten jeweils ein Cystein (Ausnahme: Peptid (129-151), welches zwei Cysteine enthält). Die Partialpeptide wurden so gewählt, daß sie die im nativen Homodimer vorhandenen Sekundärstrukturelemente besaßen, jedoch nicht mit allen Nachbarn der Cysteine in der vollendeten Tertiärstruktur kontakt hatten. Die resultierenden Partialoberflächen ergeben somit eine Vergleichsgröße zu noch nicht disulfidverbrückten Faltungsintermediaten. Der Radius der Probenkugel betrug 1.4 Å. Die mit den Standard VdW Radien des Programms INSIGHT II berechneten Oberflächen der Cysteine des Homodimers bzw. in den Polypeptidketten sind in Tab. 12 bzw.Tab. 13 dargestellt.
Abb. 87: Schematische Darstellung des Querschnitts eines beliebigen Moleküls zur Verdeutlichung der Definitionen von VdW, AS, CA und RA Oberflächen. Die Connolly Oberfläche ist als Summe von CA und RA definiert.
Tab. 12: Connolly Oberflächen der S-Atome der Cysteine im verkürzten rhM-CSF Dimer.
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Tab. 13: Connolly Oberflächen der S-Atome der Cysteine der konstruierten Polypeptidketten des verkürzten rhM-CSF Dimers.
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Die berechneten Werte für das rhM-CSF Dimer (Tab. 12) zeigen, daß alle Cysteine und damit auch die Disulfidbrücken innerhalb der Struktur verborgen liegen. Nur die Cys7-Cys90 Disulfidbrücke zeigt in einem Monomer eine geringe Oberflächenzugänglichkeit. Die unterschiedlichen Werte der Oberflächenzugänglichkeiten der Cys-S-Atome der einzelnen Monomeren können auf der Auflösung der Struktur (2.5 Å) und dem R-Wert (20 %) beruhen.
Die berechneten Oberflächenzugänglichkeiten (TA) der Cys-S-Atome in den einzelnen Partialpeptiden des rhM-CSF (Tab. 13) zeigen aufgrund der fehlenden Tertiärstrukturelemente deutlich größere Oberflächen. Die flexiblen Teile des rhM-CSF (Aminosäuren 149-221) und damit die Cysteine Cys157 und Cys159 sind in der Röntgenstruktur nicht enthalten.
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2.7 Charakterisierung der in vitro Rückfaltungsreaktion von rhM-CSF |
Diese Seite wurde erstellt am 15. März 1998. Letzte Änderungen am 30. Juni 1998 durchPeter Happersberger.