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4. Zusammenfassung
Zielsetzung dieser Arbeit war die Anwendung proteinchemischer und massenspektrometrischer Methoden zur Charakterisierung von Disulfidstrukturen in Proteinen. Zur Derivatisierung von Cysteinthiolgruppen in reduziert vorliegenden Modellpeptiden und -proteinen sollten erstmals phenylsubstituierte Arsonigsäurederivate verwendet werden, die bevorzugt mit Biscysteinylthiolgruppen makrozyklische Arsonigsäuredithioester bilden. Diese sollten als neue Methode zur Stabilisierung und zur Charakterisierung von Faltungsintermediaten einer in vitro-Rückfaltungsreaktion des Cytokins Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktors (rhM-CSF) angewandt werden.
Die Verbindungen Pyridin-3-arsonige Säure (PYR) und p-(4,6-Diamino-s-triazin-2-yl)aminophenylarsonige Säure (Melarsen Oxid, MEL) wurden dargestellt und durch1H-NMR-, UV-Spektroskopie, Elementaranalyse, EI-MS, FAB-MS, MALDI-MS und ESI-MS charakterisiert. Durch EI-MS und insbesondere durch ESI-MS konnte direkt das strukturelle Gleichgewicht zwischen freier Arsoniger Säure und dem korrespondierenden oligomeren Arsonigsäureanhydrid charakterisiert werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, daß MEL in Lösung überwiegend in Form der freien Arsonigen vorliegt, während PYR in Lösung oligomere Anhydride vom Dimer bis zum Decamer bildet. Des weiteren wurde gefunden, daß MEL und PYR unter sauren Bedingungen mit den Alkoholfunktionen der FAB-/MALDI-Matrices zu Arsonigsäurediester reagieren.
Für die synthetisierten Verbindungen MEL und PYR, sowie für die p-Aminophenylarsonige Säure (A-PAA) wurde das langwelligste Absorptionsmaximum, der Extinktionskoeffizient und dadurch die Löslichkeit in Methanol/Wassergemischen und rein wäßrigen Puffersystemen bestimmt. Alle Verbindungen zeigten eine deutlich höhere Löslichkeit als die bisher verwendete Phenylarsonige Säure (PAA) und ermöglichen damit Modifizierungsreaktionen mit höheren molaren Überschüssen an Modifizierungsreagenzien bzw. Modifizierungsreaktionen in rein wäßrigen Puffersystemen und erfüllen damit eine wichtige Voraussetzung zur Untersuchung von Proteinfaltungsreaktionen.
UV-spektroskopische Untersuchungen der Reaktion von MEL mit den Dithiolen 2,3-Dimercaptopropanol (DMP), 1,4-Dithiothreitol (DTT), sowie mit dem Peptid Oxytocin (OT) nach Reduktion mit Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) zeigten, daß in unseren Händen die Modifizierungsreaktionen mit MEL chemisch bisthiol- bzw. biscysteinylselektiv, in einer 1:1 Stöchiometrie über einen pH-Bereich von 8 bis 2 erfolgten. Die quantitative Umsetzung der eingesetzten Dithiolkomponente zum (makro)zyklischen Arsonigsäuredithioester gelang somit bereits bei minimalen molaren Überschüssen an MEL. Weitere UV-spektroskopische Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf der Modifizierungsreaktion zeigten, daß die Reaktion im Basischen (pH 8) innerhalb von 15-30 s , im Sauren (pH 2) innerhalb einer Stunde quantitativ erfolgt. Erstmals wurde gezeigt, daß die UV-spektroskopischeUntersuchung der Modifizierungsreaktion von cystinhaltigen Peptiden / Proteinen durch den Einsatz von TCEP als nicht-thiolhaltigem Reduktionsmittel in Kombination mit MEL, dem Arsonigen Säure-Derivat mit der langwelligsten und intensivsten Absorption, möglich ist.
Die Umsetzungsprodukte der Arsonigen Säurederivate PAA, PYR, A-PAA und MEL mit reduziert vorliegenden Modellpeptiden wurden massenspektrometrisch (PD-MS, ESI-MS, MALDI-MS) untersucht. Es zeigte sich, daß die Arsonigen Säurederivate PAA, A-PAA und MEL chemisch selektiv mit den Biscysteinlyfunktionen der Modellpeptide reagierten. Für PYR erhält man jedoch - zumindest bei hohen molaren Überschüssen - unspezifische Zweifachmodifizierungen. UV-spektroskopische und MALDI-massenspektrometrische Untersuchungen der Umsetzung von MEL mit nicht reduziertem Oxytocin, sowie die hochauflösende ESI-FT-ICR-MS-Analyse der Umsetzungsprodukte von teilreduziertem Vasopressin mit PYR zeigten, daß sich die Arsonigen Säurederivate gegenüber Disulfidbindungen völlig inert verhielten.
MALDI-massenspektrometrische Stabiltätsuntersuchungen an HPLC-gereinigtem, MEL-modifizierten Vasopressin zeigten ferner, daß die zyklischen Arsonigsäuredithioester im basischen Mileau und insbesondere in nukleophilen Puffersystemen nur mäßig stabil sind, während in sauren Puffersystemen geringe bzw. keine Hydrolyse in den untersuchten Zeiträumen zu beobachten ist. Diese chemische Eigenschaft der reversiblen MEL-Modifizierung kann zur gezielten Abspaltung nach erfolgter Strukturcharakterisierung für weiterführende Untersuchungen, wie beispielsweise biologische Aktivitätsuntersuchungen von Faltungsintermediaten, angewendet werden. Die UV-spektroskopischen und MALDI-massenspektrometrischen Untersuchungen zur Stabilität der MEL-Modifizierung in Gegenwart weiterer cysteinylthiolselektiver Alkylierungsmittel und zur Spaltung der As-S-Bindung mit Dithiolen führten darüber hinaus zur Entwicklung eines analytischen Konzepts zum Einsatz von MEL als tertiärstrukturselektive Schutzgruppe für räumliche nahe Cysteinreste in Proteinen. Erste proteolytische Abbaureaktionen wurden den hier gefundenen Stabilitätsbedingungen angepaßt.
Der Verlauf der Modifizierungsreaktionen der Proteine SP-C, Insulin, BPTI und rhM-CSF mit MEL wurde UV-spektroskopisch verfolgt und die Reaktionsprodukte per MALDI-MS-Analyse charakterisiert. Die Umsetzungen lieferten vollständig modifizierte Proteinderivate und unspezifische Modifizierungen waren nicht feststellbar. Dank des breiten pH-Bereichs der hier erarbeiteten Kombination aus Reduktion und Thiolmodifizierung, konnten MEL-modifizierte Proteinderivate, die sich im Alkalischen als schwer löslich zeigten, durch Durchführung der Modifizierungsreaktion im Sauren erzeugt und massenspektrometrisch untersucht werden.
Die in vitro-Rückfaltungsreaktion von DTT-reduziertem, sowie erstmals TCEP-reduziertem und vollständig denaturiertem rhM-CSF gelang gleichermaßen. Der zeitliche Verlauf für beide Rückfaltungsreaktionen wurde durch IAA-Alkylierung und MEL-Modifizierung der Faltungsintermediate verfolgt. Die MEL-modifizierten Faltungsintermediate wurden durch Ultrafiltration in ein Lösungsmittelgemisch aus 0.1% TFA / 0.1% TFA in ACN 6:4 bei pH 2 gleichzeitig gereinigt und stabilisiert. Die Molekulargewichtsbestimmung der modifizierten Faltungsintermediate erfolgte mittels MALDI-MS und SDS-Gelelektrophorese. Sowohl SDS-PAGE wie MALDI-MS zeigten die zunehmende Bildung des Homodimers im Verlauf der Rückfaltungsreaktion. Jedoch nur durch die MALDI-MS Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß in Korrelation dazu der Modifizierungsgrad der Faltungsintermediate abnahm (und damit die Anzahl an gebildeten Disulfidbindungen zunahm). Aufgrund der größeren Massendifferenz pro eingeführter MEL-Modifizierung im Vergleich zur IAA-Alkylierung, lassen sich zu einem gewählten Zeitpunkt der Faltungsreaktion rhM-CSF-Faltungsintermediate mit verschiedener Anzahl an MEL-Modifizierungen und damit ausgebildeter Disulfidbrücken unterscheiden. Somit steht mit dem dargestellten Melarsen Oxid (MEL) ein leistungsfähiges, biscysteinylselektives Modifizierungsreagens zur Verfügung, das in Kombination mit massenspektrometrischen Methoden die Charakterisierung von Disulfidstrukturen in Faltungsintermediaten von Proteinen ermöglicht.
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Diese Seite wurde erstellt am 15. März 1998. Letzte Änderungen am 30. Juni 1998 durchPeter Happersberger.